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CRISPR技術簡介及運用

CRISPR/Cas9技術簡介

CRISPR/Cas系統是在大多數細菌(40%)和古細菌(90%)中發現的一種天然免疫系統,可用來對抗入侵的病毒及外源DNA。
CRISPR指的是規律成簇的間隔短回文重復(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)。 Cas(CRISPR-associated genes)為CRISPR相關基因。
當噬菌體感染細菌后,病毒DNA進入細菌細胞,細菌細胞表達Cas復合體對噬菌體DNA進行切割得到間隔序列,間隔序列在cas1 和cas2作用下插入到CRISPR最前端(如圖Phase1)形成免疫。




當噬菌體再次感染細菌時,以較為簡單的Type II型CRISPR/Cas系統為例,細菌表達 tracrRNA、前體crRNA及Cas9蛋白(RNA引導的核酸內切酶),tracrRNA和crRNA由于部分序列互補而結合,Cas9與tracrRNA和crRNA形成復合體并由Cas9加工成為成熟crRNA-tracrRNA Cas9復合體,成熟復合體由間隔序列引導識別病毒靶序列,并切斷病毒DNA(如圖Phase2)。復合體只能識別與間隔序列一致并且3'端含PAM(protospacer adjacent motif原間隔序列鄰近模塊序列,如不同來源CRISPR/Cas9系統有不同序列,如鏈球菌CRISPR/Cas9系統PAM序列未NGG)的靶序列,即PAM原間隔序列鄰近模塊序列,這是CRISPR/Cas9不剪切自身間隔序列的原因。



2013年1月,在Science上發表了兩篇以鏈球菌CRISPR/Cas9系統為基礎對哺乳動物細胞進行基因組編輯新方法,利用一條gRNA(guid RNA)模擬成熟的 crRNA-tracrRNA復合體與Cas9共同作用切割靶基因組(如下圖),由此揭開了該技術的運用高潮。





到目前為止CRISPR/Cas已經運用到了各種細胞以及大腸桿菌、釀酒酵母、擬南芥、煙草、高粱、水稻、小麥、線蟲、果蠅、蠶、斑馬魚、非洲爪蟾、小鼠、大鼠、豬、羊等,從最低等的微生物到哺乳動物的基因敲除修飾或突變,另外一方面其強大的基因組編輯能力已經用于生物治療,如 HIV HBV等RNA病毒引起的疾病治療研究,單基因或多基因遺傳病治療研究,癌癥治療研究等方面。


CRISPR/Cas相比其它基因組編輯技術,如鋅指核酸酶(ZFNs)或轉錄激活因子樣效應物核酸酶(TALENs),操作更簡單,同時更容易針對同一細胞中的多個基因位點進行編輯,該系統可成為替代目前基因組工程方法的一種更安全,毒性更低的新方法。


CRISPR技術運用:

CRISPR技術可運用于各種細胞,各個物種基因敲除,敲入,修飾或突變等,另外利用失去核酸酶活的Defect Cas9與不同功能結構域融合,可以實現基因干擾,激活,染色體染色,特定DNA純化等特殊功能。

1、基因敲除(Gene Knockout)
利用雙剪切或同源重組直接移除miRNA/lncRNA基因序列或蛋白編碼基因的關鍵外顯子,使其發生移碼突變,從而使靶基因功能完全丟失。

2、基因敲入(Gene Knockin)
通過基因斷裂誘導的同源重組,選擇性將靶基因敲入Rosa26位點(人細胞選擇敲入類似基因THUMPD3-AS1),靶基因可以是小RNA,lncRNA或蛋白編碼基因,條件性敲入還可實現基因表達的實時控制。

3、基因修飾/突變(Gene Modification/Mutation)
通過基因斷裂誘導的同源重組,可以在原基因中插入報告基因或標簽序列,實現目的基因的檢測、追蹤和功能研究;也可以改變原有基因的編碼序列來研究其對基因功能的影響。

4、基因編輯以外的運用(Other Applications)
利用dCas9(Defect Cas9)與特殊功能蛋白結構域的融合表達,還可使其發揮特殊功能。與轉錄激活或轉錄抑制蛋白結構域的融合表達,還可實現特定基因的過表達或干擾;與熒光蛋白的融合表達,可用于染色體染色;與表面抗原的融合,可用于純化特定基因組片段等。


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