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吉瑪新聞
  • RT-PCR指南
  • 作為一種新型的PCR技術,Real-Time PCR技術將熒光信號強弱與PCR擴增情況結合在一起,與通過監測PCR反應管內熒光信號的變化來實時觀測PCR反應進行的情況,解決了傳統PCR難以對擴增起始模板的量進行測定的難題,并具有快速、避免交叉污染等特點,在基因檢測、基因表達、SNP分析等領域得到廣泛的應用。

     

    定量PCR對起始模板定量

     
     

    應用定量PCR進行基因表達研究

    快速、高效、高通量是應用定量PCR進行基因表達研究的特點,可在2個半小時內同時完成對多個基因的表達研究。

     
     

    絕對定量和相對定量

    研究者在實驗中如果想要得到目的基因的絕對量,則應采用絕對定量的方法;如果只是需要知道目的基因相對與某一基因(通常是管家基因)的表達情況,則可采用相對定量的方法。
    絕對定量最為簡單的方法就是標準曲線法,用一系列已知濃度的標準品制作標準曲線,得到目的基因的Ct值后再利用標準曲線換算出目的基因的絕對量。標準品可以是純化的質粒dsDNA,體外轉錄的RNA,或者是體外合成的ssDNA。
    絕對定量有外標和內標兩種定量方法。外標法指的是標準品和目的基因在不同反應管內擴增,這種定量方法的一個前提條件是標準品和目的基因的擴增效率是一致的,然而事實上,在絕大多數的實驗中,要想使標準品和目的基因的擴增效率完全一致是不可能的;外參照的標準品無法檢測也不可能補償可能出現在目的基因反應體系中的影響因素,如PCR抑制子等。此外,外標法還常受標準品制作、標準品穩定性及實驗操作等因素的影響。
    為反映體系中可能出現的PCR影響因素,可引入一個內標同目的基因在同一反應體系中同時進行擴增。內標法又可分競爭性內標和非競爭性內標。競爭性內標具有與目的基因序列相同的引物結合位點,但不具有相同的探針結合位點;非競爭性內標則既不和目的基因共用引物也不共用探針。相對比較常用的是競爭性內標法。由于競爭性PCR能夠消除反應體系中干擾因素的影響,所以它所等到的結果要準確可靠得多,但是由于在反應體系中同時擴增兩種模板,使得其結果的測定范圍比單使用外參要大為縮小,往往只有2-3個數量級,此外內標法還應考慮的因素是競爭性抑制效應。實驗者可根據實驗的具體情況選擇是采用外標定量還是內標定量的方法。

     

    相對定量較為早期的方法是用一系列已知外參物做標準曲線,根據該標準曲線得到目的基因和管家基因的量,再將目的基因同管家基因的比值作為定量的最后結果。目前更為常用的方法是2-△△Ct 方法,在該公式中,ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)實驗組-( Ct目的基因- Ct管家基因)對照。2-△△Ct表示的是實驗組目的基因的表達相對于對照組的變化倍數,使用這一方法可以直接得到的目的基因相對于管家基因的量,而不必制作標準曲線,所以更為簡便省時。但此方法要求目的基因和管家基因的擴增效率一致,然而實際情況往往并非如此。
    為此,可在2-△△Ct 方法的基礎上引入效率評價即(1+E)-△△Ct 方法,其中E為擴增效率。計算擴增效率可以采用標準曲線斜率換算法,此方法為梯度稀釋目的基因擴增片斷及管家基因擴增片斷,PCR后分別建立兩條標準曲線并根據斜率計算擴增效率,計算公式為E=10-1/slope
    。另一種計算擴增效率的方法為觀察PCR剛進入指數擴增期階段的熒光強度變化,計算公式為Yn=Yo×En 。有的定量PCR儀的操作軟件具有自動計算擴增效率的功能,無需實驗工作者另行計算PCR擴增效率。

     
     
     

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