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吉瑪新聞
  • RNAi指南
  • RNAi技術發展的歷程

    1998:植物基因中基因沉默現象的發現
    2000:哺乳動物細胞中基因沉默的實現
    2001:被《科學》評為當年十大科技突破之一
    2003:動物體內觀察到RNA干擾作用
    2004:在恒河猴上的SARS病毒研究取得進展
    2004:Acuity Pharmaceutical 第一個RNA干擾藥物申請IND
    2004:siRNA Therapeutics 第一個RNA干擾藥物申請IND
    2005:第一個RNA干擾藥物進入一期臨床,取得良好的效果
    2005:化學修飾的siRNA oligo 體內系統給藥取得突破
    2006:Andrew Z. Fire和Craig C. Mello因在RNA干擾領域的成就獲得諾貝爾醫學/生理學獎

     

    RNAi實驗原理

    RNA干擾(RNA interfering,RNAi)現象是由與靶基因序列同源的雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)引發的廣泛存在于生物體內的序列特異性基因轉錄后的沉默過程。細胞中的核糖核酸酶III家族成員之一的,dsRNA特異性的核酸酶Dicer將dsRNA裂解成由21-25個核苷酸組成的小干擾RNA (small interfering RNA,siRNA),隨后siRNA作為介導子引起特異性地降解相同序列的mRNA,從而阻斷相應基因表達的轉錄后基因沉默機制。

     

    上海吉瑪公司以國際上最先進的設計理念為依托,綜合我們對RNAi文庫篩選以及從客戶反饋的結果,上海吉瑪公司優先考慮的設計原則有以下幾個方面:

    1. siRNA 設計原則

    1.siRNA雙鏈末端的熱穩定性,即的值

    2.siRNA雙鏈的反義鏈末端最后兩個堿基的選擇,即:20,21位置堿基的選擇

    3.siRNA雙鏈的反義鏈第1和第19位置的堿基的選擇

    4.siRNA反義鏈的G+C的含量

    5.siRNA反義鏈的第2位和第18位置的堿基的選擇

    6.siRNA反義鏈的第2位到17位局部穩定性的選擇

    7.siRNA雙鏈的正義鏈為基準,整個雙鏈穩定性的分布為,5’末端穩定性強,雙鏈中間段,以斷裂位點周圍為例,穩定性較弱,3’段穩定性較弱

    Sense:

    5’ NNNNNNNNNNNNNNNNNNN TT

    3’

    antisense:

    3’ NN NNNNNNNNNNNNNNNNNNN

    3’

    mRNA:

    5’ dNdN NNNNNNNNNNNNNNNNNNN

    3’

    注:正義鏈sense: 19堿基的靶點+TT懸頭

    反義鏈antisense:21個堿基完全與靶點互補

    反義鏈最后兩個堿基為脫氧核酸dNdN

    2.shRNA設計原則

    shRNA設計原則與siRNA設計原則相比有其特殊性。源于shRNA的siRNA相對于外源導入的siRNA在細胞內的有效濃度要低。shRNA末端設計以及雙鏈的熱穩定性是以DNA設計為基礎,而siRNA是以mRNA為基礎。

    1. 從轉錄本(mRNA)的AUG起始密碼開始,尋找“AA或者NA”二連序列,并記下其3'端的19個堿基序列,作為潛在的siRNA靶位點。正義鏈和反義鏈都采用這19個堿基(不包括AA或者NA重復)來設計。
    2. 避免在起始密碼子或無義區域附近選擇目的序列。
    3. siRNA序列的GC含量應為30%-60%左右。
    4. 在設計siRNA時不要針對5'和3'端的非編碼區(untranslated regions,UTRs),原因是這些地方有豐富的調控蛋白結合區域,而這些UTR結合蛋白或者翻譯起始復合物可能會影響siRNP核酸內切酶復合物結合mRNA從而影響siRNA的效果。
    5. 將挑選的序列在公共數據庫中進行比較以確保目的序列與其它基因沒有同源性。
    6. 將潛在的序列和相應的基因組數據庫進行比較,排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。例如使用BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。由于沒有完整的蝦的基因組序列,比對起來相對困難。
    7. 選出合適的目標序列進行合成。通常一個基因需要設計多個靶序列的siRNA,以找到最有效的siRNA序列。
    8. 陰性對照:一個完整的siRNA實驗應該有陰性對照,作為陰性對照的siRNA應該和選中的siRNA序列有相同的組成,但是和mRNA沒有明顯的同源性。通常的做法是將選中的siRNA序列打亂,同樣需要檢查它和其他基因是否具有同源性。
    9.有結果顯示,UU結尾和dTdT結尾的siRNA在效果上沒有區別,因為這個突出端無需和靶序列互補。合成siRNA時可直接提供以AA打頭的21個堿基序列。


    研究基因功能的新工具

     

    由于RNAi具有高度的序列專一性和有效的干擾,可以特異地將特定的基因沉默,從而獲得基因功能喪失或基因表達量的降低,因此可以作為功能基因組學的一種強有力的研究工具。目前已經進入應用RNAi研究基因功能的告訴發展的時期,抓住這個強力有力的工具,抓住機遇,加速基因功能的研究。

     

    基因治療

    隨著對疾病本質的深入了解和新的分子生物學技術的出現,廣義上把凡是通過改變人體內的基因表達以達到治療疾病的方法均可稱為基因治療(gene therapy)。用RNAi特異性地抑制如艾滋病病毒基因、肝炎病毒基因、癌基因、癌相關基因或突變基因的過度表達,使這類基因保持在靜默或休眠狀態,從而有望用這種新的手段治療各種病毒性疾病和惡性腫瘤等疑難病癥。

     

    藥物開發

    RNAi技術可以作為尋找新的藥物靶標的工具,可以快速、大規模、高通量的對發現的藥物靶基因進行功能分析。同時,siRNA基因藥物具有高度的序列特異性和非常小的毒副作用。利用這個技術可以用于確定人類細胞中的疾病途徑,為小分子藥物篩選靶物質,以及建立新的生物制藥方法和診斷學方法。再者,它還能幫助鑒定藥物作用的生化模式,以及其他與此作用相關的基因。RNAi技術已被作為高通量藥物靶標識別和確認的工具之一。

     

    吉瑪公司為客戶提供RNA干擾技術品種齊全的產品

     

    RNAi方法的選擇

     
     

    化學合成法的優越性

    GenePharma公司可以根據用戶要求提供高質量的化學合成siRNA。l 最省時—四天內到貨l 最省事—設計都可以委托GenePharma公司免費完成, 收到siRNA oligo后直接與轉染試劑混合就可開始實驗l 最省錢—500元/對, 三對里就應該有一對抑制效率在70%以上

     

    化學修飾stableTM siRNA oligo

    RNAi技術的最大難題就是化學合成siRNA穩定性問題。GenePharma化學修飾stableTM siRNA最大的目標就是一次性獲得最佳的實驗數據。我們的方法就是使用RNAi-Mate轉染試劑將化學修飾stableTM siRNA導入哺乳動物細胞中,獲得如下滿意結果:

    1. 高效的基因沉默
    2. 高穩定性—在血清和培養基中
    3. 最大限度減少副作用

    更長的作用時間

     

    化學修飾stableTM siRNA oligo與普通的siRNA oligo性能對照表

     

    關鍵難題

    標準的siRNA

    化學修飾stableTM siRNA

    siRNA 降解

    標準的非修飾的siRNA在細胞培養過程中很容易降解雖然在大部分的離體實驗中是有效的,但是在細胞培養中壽命較短。

    GenePharma化學修飾stableTM siRNA不僅增強了在血清和細胞培養中的壽命,而且加強了在離體條件下的應用能力。

    作用時效

    作用時間較短,一般情況下為一周左右。

    GenePharma化學修飾stableTM siRNA作用時間長,比標準的siRNA的作用時間延長一倍左右

    活體應用的活性

    標準的siRNA穩定性較差,一般不適用于體內試驗

    GenePharma化學修飾stableTM siRNA在體內的穩定性強。

     

    shRNA表達載體法

    多數的shRNA表達載體依賴三種RNA聚合酶III 啟動子(pol III)中的一種,操縱一段小的發夾RNA(short hairpin RNA, shRNA)在哺乳動物細胞中的表達。這三類啟動子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6啟動子和人源的H1啟動子。之所以采用RNA pol III啟動子是由于它可以在哺乳動物細胞中表達更多的小分子RNA,而且它是通過添加一串(3到6個)U來終止轉錄的。要使用這類載體,需要訂購2段編碼短發夾RNA序列的DNA單鏈,退火,克隆到相應載體的pol III 啟動子下游。GenePharma公司的shRNA表達載體的優點在于可以進行較長期研究,載體可以在細胞中持續抑制靶基因的表達,持續數星期甚至更久。

     

    siRNA 套餐服務

    客戶只需提供基因序列GeneID或者Accession number, 我們免費幫您設計選擇合適的位點,保證至少有一對可以有效的抑制相應基因的表達,抑制效率可達70%以上,如果沒有篩選出有效的siRNA 片段,吉瑪公司為您免費再次設計與合成。

     

    shRNA套餐服務

    shRNA表達載體帶有抗生素標記,可以在細胞中持續抑制靶基因的表達,持續數星期甚至更久。對于一個已知有效的 siRNA序列(例如,經過siRNA合成方法篩選獲得的),需要維持較長時間的基因沉默時,推薦使用shRNA載體系統。GenePharma公司致力于提供最先進和最方便的shRNA相關工具,最近推出新一代shRNA表達質粒,一種高效即用型載體,該載體在細胞內可以持續產生shRNAs,從而達到持久抑制目標基因表達的目的。針對目的基因設計并制備4個shRNA載體,確保4個shRNA中至少一個在mRNA水平的基因的抑制效率在70%以上.

     

    RNAi經典參考文獻

    1.Cogoni C, and Macino G. (2000) Post-transcriptional gene silencing across kingdoms. Genes Dev 10: 638-643.
    2.Guru T. (2000). A silence that speaks volumes. Nature 404, 804-808.
    3.Hammond SM, Caudy AA, Hannon GJ. (2001) Post-transcriptional Gene Silencing by Double-stranded RNA. Nature Rev Gen 2: 110-119.
    4.Guo S, and Kempheus KJ. (1995). Par-1, a gene required for establishing polarity in C. elegans embryos, encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed. Cell 81: 611-620.
    5.Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, and Mello CC. (1998). Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391: 806-811.
    6.Timmons, L., and Fire, A. (1998) Specific interference by ingested dsRNA. Nature 395: 854.
    7.Timmons L, Court D, and Fire A. (2001) Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene 263:103-112.
    8.Tabara H, Grishok A, and Mello CC. (1998) RNAi in C. elegans: soaking in the genome sequence. Science 282: 430-431.
    9.Grishok A, Tabar H, and Mello CC. (2000) Genetic requirements for inheritance of RNAi in C. elegans. Science 287: 2494-2497.
    10.Sharp PA, and Zamore PD. (2000) RNA Interference. Science 287: 2431-2433.
    11.Sharp PA. RNA Interference-2001. (2001) Genes Dev 15: 485-490.
    12.Kennerdell JR, and Carthew RW. (1998) Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell 95: 1017-1026.
    13.Kennerdell JR, and Carthew RW. (2000) Heritable gene silencing in Drosophila using double-stranded RNA. Nature Biotech 18: 896-898.
    14.Hamilton AJ, Baulcombe DC. (1999) A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants. Science 286: 950-952.

     

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